甲真菌病的診斷主要依賴於甲屑的直接鏡檢和培養。
真菌學檢查
收集足夠的標本是關鍵，遠端甲下型可用刮匙、牙科刮鏟及甲起子取甲下碎屑；近端甲下型可用甲鑽或解剖刀，白色淺表型可用刮匙，刮取病變區和正常區交界部位靠近甲牀的甲屑，加10%氫氧化鉀（KOH）直接鏡檢。見到分支菌絲即可支持診斷。需要注意的是，青黴、麴黴、頭孢、鐮孢，殼蠕孢和白念珠菌等可形成菌絲與假菌絲而與皮膚癬混淆。沙堡瓊脂培養應採用兩管法（其一不含放線菌酮），培養6～8周。
組織病理學
病甲角質增厚，疏檢，角質細胞呈網籃狀排列，並有不同程度的破壞，可見裂隙、空腔。甲板內如見細長規則菌絲或關節菌絲，提示爲皮膚癬菌，其菌絲多橫行生長，少數斜行或縱行生長，有的檢出圓形或橢圓形的小細胞，聚集成團，可見芽生孢子、假菌絲及厚壁孢子，提示爲酵母菌。這些菌細胞多位於甲板內層，少數見於甲板外層或中層；甲板中若出現不規則的粗大菌絲，有葉狀結構，色澤不均勻，部分呈褐色或黑褐色，生長紊亂，則提示爲非皮膚癬菌性真菌。
